Офтальмик в linked in Офтальмик в твиттере Офтальмик вконтакте Статистика сайта Офтальмик.ру
Генетическая диагностика глазных болезней
.:: Новости ::: О компании ::: Услуги ::: Цены ::: Гены ::: Пациентам ::: Лечение ::: FAQ ::: Контакты ::. 
 
Диагностируем:
· Катаракта
· Глаукома
· Макулярная дегенерация
· Близорукость
· Пигментный ретинит
· Дистрофии сетчатки
· Дистрофии роговицы
· Увеиты
· Ретинобластома
· Амавроз Лебера
· Микрофтальм
· Анофтальм
· Аксенфельда-Ригера
· Ваарденбурга синдром
· Ретиношизис
· Косоглазие
· Выезд окулиста на дом
· Синдром Ашера
· Редкие болезни
 
 
Обучение
· Конференции
· Книги по офтальмогенетике
· Книга О.В. Хлебниковой Наследственная патология органа зрения
· Методы исследования в офтальмологии
· Классификация наследственных болезней сетчатки
· Критерии клинической классификации
· Форум по молекулярной медицине 2013
· Анализ геномных NGS данных
 
 
Пороки развития
· размеров и формы глаза
· придаточного аппарата
· роговицы
· сосудистой оболочки глаза
· хрусталика
· сетчатки
· зрительного нерва
· МУТАНТНЫЕ БЕЛКИ
 
 
Типы диагностики
· CLIA - что это?
· Кариотипирование
· FISH анализ
· SKY тест
· SSDGE или SSCP
· DGGE
· RFLPs
· Специфичный микрочип
· Типичный микрочип
· Прямое секвенирование
 
 
Панели тестов
· Панель "цилиопатии"
· Панель "пигментный ретинит"
· Панель "все глазные заболевания"
· Животные модели
· Пигментный ретинит: новости 2013
· Метаболизм сетчатки
· Дегенерация сетчатки и клеточная биология
 
 

Секвенирование нового поколения. Объяснение технологии

В ноябре 2006 года компания Illumina купила компанию Solexa за 600 млн. долларов, что дало возможность выхода на рынок секвенирования нового поколения.

На основе этого метода разрабатывается все больше диагностических панелей ("цилиопатии", "скрининг глазных заболеваний"), так как это дешевле, точнее и более подробно, чем диагностические панели единичных генов.

В данном коротком обзоре приведена химия секвенирования путем синтеза в технологии Solexa. Подготовка образца немного отличается от такового в системе ABI's SOLiD, но основные цели те же: сгенерировать большое количество уникальных «полоний» (полимераза сгенерированных колоний), которые могут быть секвенированы в случайном порядке. Эти параллельные реакции происходят на поверхности flow - cell (обычно на водонепроницаемом предметном стекле), которое предоставляет большую площадь поверхности для многих тысяч параллельных химических реакций.

flow cell illumina чип Иллюмина

кювета (flow cell) компании Иллюмина (Illumina)

Шаг 1. Подготовка образца

Исследуемый образец ДНК разрезают на кусочки подходящего размера (ок. 800 пар оснований), используя пневматическое устройство под названием небулайзер. Концы ДНК зачищаются и два уникальных адаптера присоединяются к фрагментам. Связанные фрагменты величиной от 150 до 200 пар оснований изолируются путем экстракции в геле и амплифицируются путем определенного количества циклов ПЦР.

Библиотека полных детальных протоколов по приготовлению ДНК и малых РНК приведена в документах, прикрепленных к данному сообщению (доступных по ссылке из оригинального источника), соответственно "dna_libe_prep.pdf" (154 кб, pdf) и "rna_libe_small_prep.pdf" (126 кб, pdf). Этот довольно простой многошаговый процесс молекулярной биологии, однако в нем есть подводные камни, которые могут привести к получению искаженных результатов на выходе. PreparingSamplesforDigitalGeneExpression-TagProfilingwithNlaIII.pdf (152 кб, pdf) , PreparingSamplesforDigitalGeneExpression-TagProfilingwithDpnII.pdf (150.5 кб, pdf) 11257047_ChIP_Sample_Prep.pdf (116 кб, pdf).

Шаги 2 – 6 Формирование кластера путем "стыковочной" амплификации (bridge amplification)

В отличие от 454 и ABI методов, в которых используют пузырьковую эмульсию ПЦР для формирования «полоний» Иллюмина применяет уникальную «стыковочную» реакцию амплификации, которая происходит на поверхности проточной кюветы (flow cell).

Секвенирование нового поколения Шаг 1. Подготовка образца геномной ДНК
Секвенирование нового поколения Шаг 2. Прикрепление ДНК к поверхности
Секвенирование нового поколения Шаг 3. Стыковочная амплификация.
Шаг 1. Подготовка образца геномной ДНК.
Рандомное фрагментирование геномной ДНК и прикрепление адаптера к обоим концам фрагмента
Шаг 2. Прикрепление ДНК к поверхности.
Рандомное связывание одноцепочечных фрагментов с внутренней поверхностью каналов кюветы.
Шаг 3. Стыковочная амплификация.
Добавление немеченных нуклеотидов и ферментов для инициации твердофазной стыковочной амплификации

Поверхность кюветы покрыта одноцепочечными олигонуклеотидами, которые отвечают на последовательности адаптеров, прикрепленных во время приготовления образца. Одноцепочечные, связанные с адаптером, фрагменты связываются с поверхностью проточной кюветы, которую затем подставляют под действие полимеразного удлинения. Прикрепление полимеразы происходит, когда свободный, дистальный конец связанного фрагмента «стыкуется» с комплиментарным олигонуклеотидом на поверхности.

Секвенирование нового поколения Шаг 4. Фрагменты становятся двухцепочечными.
Секвенирование нового поколения Шаг 5. Денатурация двухцепочечных молекул
Секвенирование нового поколения Шаг 6. Полная амплификация
Шаг 4. Фрагменты становятся двухцепочечными.
Фермент встраивает нуклеотиды в дополнительную комплиментарную цепь двухспиральных стыковочных участков на твердофазном субстрате
Шаг 5. Денатурация двухцепочечных молекул.
Денатурация приводит к тому, что одноцепочечные шаблоны остаются прикрепленными (заякоренными) к субстрату
Шаг 6. Полная амплификация.
Несколько миллионов плотных кластеров двуцепочечной ДНК генерируются на каждом канале кюветы

Повторяемый цикл денатурации и удлинения цепи приводит к местному умножению количества копий (амплификации) единичной молекулы в миллионах разных точек по всей поверхности кюветы. Этот процесс происходит в так называемой в компании Иллюмина «кластерной станции» (cluster station).

Шаги 7 – 12 Секвенирование путем синтеза

Кювета, содержащая миллион уникальных последовательностей (кластеров), загружается в 1 G секвенатор с автоматическими циклами удлинения и анализа.

Первый цикл секвенирования состоит в поглощении одного флуоресцентного нуклеотида, затем идет фотография (регистрация) с высоким разрешением всей кюветы, всей площадки. На картинках представлены данные, которые получаются для первого основания. Любой сигнал выше фонового означает физическое расположение кластера (или полонии), а эмиссия света (флуоресценция) определяет, какое из четырех видов оснований (A , C , G , T) попало на эту позицию.

Секвенирование нового поколения Шаг 7. Определение первого основания
Секвенирование нового поколения Шаг 8. Снять изображение (первый снимок, фотография) с первых нуклеотидов
Секвенирование нового поколения Шаг 9. Определение второго основания
Шаг 7. Определение первого основания.
Первый химический цикл: инициировать первый цикл секвенирования, добавить все четыре обратимо меченных терминатора (обрывателя), праймеры и ДНК-полимеразу к кювете.
Шаг 8. Снять изображение (первый снимок, фотография) с первых нуклеотидов.
После возбуждения лазером регистрируют картинку эмиттированной флуоресценции от каждого кластера на кювете. Записывают тип (A,С,G,T) первого основания в каждом кластере
Шаг 9. Определение второго основания.
Второй химический цикл: инициировать следующий цикл секвенирования, добавить все четыре обратимо меченных терминатора (обрывателя), праймеры и ДНК-полимеразу к кювете.

Этот цикл повторяется по одному основанию в единицу времени, получается серия картинок, каждая из которых представляет удлинение цепи на 1 нуклеотид в определенном кластере («полонии»). Тип оснований определяют с помощью алгоритма, определяющего цвет эмиссии в каждый момент времени. На текущий момент длина ридов Иллюмины с полезной информацией 26 – 50 пар оснований.

Секвенирование нового поколения Шаг 10. Снять изображение (второй снимок, фотография) со вторых нуклеотидов
Секвенирование нового поколения Шаг 11. Просеквенировать риды большим количеством химических циклов
Секвенирование нового поколения Шаг 12. Сопоставить полученные данные
Шаг 10. Снять изображение (второй снимок, фотография) со вторых нуклеотидов.
После возбуждения лазером регистрируют картинку эмиттированной флуоресценции от каждого кластера на кювете, как раньше. Записывают тип (A,С,G,T) второго основания в каждом кластере
Шаг 11. Просеквенировать риды большим количеством химических циклов.
Повторять циклы секвенирования, чтобы определить последовательность нуклеотидов в данном фрагменте, один нуклеотид за один раз.
Шаг 12. Сопоставить полученные данные.
Сопоставить полученную последовательность нуклеотидов с референсной и выявить различия в последовательности.

Применение физического местоположения для идентификации уникальных ридов – критичный концепт для всех систем секвенирования нового поколения. Плотность ридов и способность получать с них картинку без шума и помех соседних точек – жизненно важный параметр для производительности конкретного инструмента (аппарата). Каждая платформа имеет свои уникальные особенности, которые определяют это количество, SOLiD 454 ограничены в числе лунок (wells) в их PicoTiterPlate, Иллюмина ограничена длиной фрагментов, которые могут эффективно «стыковываться» и все компании ограничены размером кюветы (буквально «жилой площадью» кюветы).

Надеюсь, данный материал послужил кратким введением в понимание технологии. Если что-то не так, поправьте. Ниже приведено видео, в котором описывается эта же технология.

 

Статья подготовлена Марианной Ивановой в октябре 2012 по материалам супер форума NGS:
http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=21 При копировании ссылка на oftalmic.ru обязательна

 
 
 
  Как собирать образцы для генетического анализа
Как собирать образцы для генетического анализа
 
  ДНК диагностика глазных болезней в России и СНГ
Мы работаем в России и странах СНГ
 
  Как проводится генетическая диагностика в офтальмологии
Как проводится ген.диагностика
 
  Цены на ДНК диагностику глазных болезней
Из чего складывается цена анализа?
 
  Как правильно рисовать генеалогическое дерево
Как правильно составлять историю здоровья семьи?
 
  секвенирование нового поколения
Используемые нами технологии
 
  клинические признаки при генетической диагностике
Необходимые для ген.анализа клинические данные
 
  Organum visus Голубев Сергей Юрьевич
Информационный партнер проекта
 
  Профессионально о зрении портал OD OS
Информационный партнер проекта
 
 
Copyright © Офтальмик 2008 - 2017