Секвенирование нового поколения. Объяснение технологии
В ноябре 2006 года компания Illumina купила компанию Solexa за 600 млн. долларов, что дало возможность выхода на рынок секвенирования нового поколения.
На основе этого метода разрабатывается все больше диагностических панелей ("цилиопатии", "скрининг глазных заболеваний"), так как это дешевле, точнее и более подробно, чем диагностические панели единичных генов.
В данном коротком обзоре приведена химия секвенирования путем синтеза в технологии Solexa. Подготовка образца немного отличается от такового в системе ABI's SOLiD, но основные цели те же: сгенерировать большое количество уникальных «полоний» (полимераза сгенерированных колоний), которые могут быть секвенированы в случайном порядке. Эти параллельные реакции происходят на поверхности flow - cell (обычно на водонепроницаемом предметном стекле), которое предоставляет большую площадь поверхности для многих тысяч параллельных химических реакций.
кювета (flow cell) компании Иллюмина (Illumina)
Шаг 1. Подготовка образца
Исследуемый образец ДНК разрезают на кусочки подходящего размера (ок. 800 пар оснований), используя пневматическое устройство под названием небулайзер. Концы ДНК зачищаются и два уникальных адаптера присоединяются к фрагментам. Связанные фрагменты величиной от 150 до 200 пар оснований изолируются путем экстракции в геле и амплифицируются путем определенного количества циклов ПЦР.
Шаги 2 – 6 Формирование кластера путем "стыковочной" амплификации (bridge amplification)
В отличие от 454 и ABI методов, в которых используют пузырьковую эмульсию ПЦР для формирования «полоний» Иллюмина применяет уникальную «стыковочную» реакцию амплификации, которая происходит на поверхности проточной кюветы (flow cell).
Шаг 1. Подготовка образца геномной ДНК.
Рандомное фрагментирование геномной ДНК и прикрепление адаптера к обоим концам фрагмента
Шаг 2. Прикрепление ДНК к поверхности.
Рандомное связывание одноцепочечных фрагментов с внутренней поверхностью каналов кюветы.
Шаг 3. Стыковочная амплификация.
Добавление немеченных нуклеотидов и ферментов для инициации твердофазной стыковочной амплификации
Поверхность кюветы покрыта одноцепочечными олигонуклеотидами, которые отвечают на последовательности адаптеров, прикрепленных во время приготовления образца. Одноцепочечные, связанные с адаптером, фрагменты связываются с поверхностью проточной кюветы, которую затем подставляют под действие полимеразного удлинения. Прикрепление полимеразы происходит, когда свободный, дистальный конец связанного фрагмента «стыкуется» с комплиментарным олигонуклеотидом на поверхности.
Шаг 4. Фрагменты становятся двухцепочечными.
Фермент встраивает нуклеотиды в дополнительную комплиментарную цепь двухспиральных стыковочных участков на твердофазном субстрате
Шаг 5. Денатурация двухцепочечных молекул.
Денатурация приводит к тому, что одноцепочечные шаблоны остаются прикрепленными (заякоренными) к субстрату
Шаг 6. Полная амплификация.
Несколько миллионов плотных кластеров двуцепочечной ДНК генерируются на каждом канале кюветы
Повторяемый цикл денатурации и удлинения цепи приводит к местному умножению количества копий (амплификации) единичной молекулы в миллионах разных точек по всей поверхности кюветы. Этот процесс происходит в так называемой в компании Иллюмина «кластерной станции» (cluster station).
Шаги 7 – 12 Секвенирование путем синтеза
Кювета, содержащая миллион уникальных последовательностей (кластеров), загружается в 1 G секвенатор с автоматическими циклами удлинения и анализа.
Первый цикл секвенирования состоит в поглощении одного флуоресцентного нуклеотида, затем идет фотография (регистрация) с высоким разрешением всей кюветы, всей площадки. На картинках представлены данные, которые получаются для первого основания. Любой сигнал выше фонового означает физическое расположение кластера (или полонии), а эмиссия света (флуоресценция) определяет, какое из четырех видов оснований (A , C , G , T) попало на эту позицию.
Шаг 7. Определение первого основания.
Первый химический цикл: инициировать первый цикл секвенирования, добавить все четыре обратимо меченных терминатора (обрывателя), праймеры и ДНК-полимеразу к кювете.
Шаг 8. Снять изображение (первый снимок, фотография) с первых нуклеотидов.
После возбуждения лазером регистрируют картинку эмиттированной флуоресценции от каждого кластера на кювете. Записывают тип (A,С,G,T) первого основания в каждом кластере
Шаг 9. Определение второго основания.
Второй химический цикл: инициировать следующий цикл секвенирования, добавить все четыре обратимо меченных терминатора (обрывателя), праймеры и ДНК-полимеразу к кювете.
Этот цикл повторяется по одному основанию в единицу времени, получается серия картинок, каждая из которых представляет удлинение цепи на 1 нуклеотид в определенном кластере («полонии»). Тип оснований определяют с помощью алгоритма, определяющего цвет эмиссии в каждый момент времени. На текущий момент длина ридов Иллюмины с полезной информацией 26 – 50 пар оснований.
Шаг 10. Снять изображение (второй снимок, фотография) со вторых нуклеотидов.
После возбуждения лазером регистрируют картинку эмиттированной флуоресценции от каждого кластера на кювете, как раньше. Записывают тип (A,С,G,T) второго основания в каждом кластере
Шаг 11. Просеквенировать риды большим количеством химических циклов.
Повторять циклы секвенирования, чтобы определить последовательность нуклеотидов в данном фрагменте, один нуклеотид за один раз.
Шаг 12. Сопоставить полученные данные.
Сопоставить полученную последовательность нуклеотидов с референсной и выявить различия в последовательности.
Применение физического местоположения для идентификации уникальных ридов – критичный концепт для всех систем секвенирования нового поколения. Плотность ридов и способность получать с них картинку без шума и помех соседних точек – жизненно важный параметр для производительности конкретного инструмента (аппарата). Каждая платформа имеет свои уникальные особенности, которые определяют это количество, SOLiD 454 ограничены в числе лунок (wells) в их PicoTiterPlate, Иллюмина ограничена длиной фрагментов, которые могут эффективно «стыковываться» и все компании ограничены размером кюветы (буквально «жилой площадью» кюветы).
Надеюсь, данный материал послужил кратким введением в понимание технологии. Если что-то не так, поправьте. Ниже приведено видео, в котором описывается эта же технология.
Статья подготовлена Марианной Ивановой в октябре 2012 по материалам супер форума NGS:
http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=21 При копировании ссылка на oftalmic.ru обязательна
