Офтальмик в linked in Офтальмик в твиттере Офтальмик вконтакте Статистика сайта Офтальмик.ру
Генетическая диагностика глазных болезней
.:: Новости ::: О компании ::: Услуги ::: Цены ::: Гены ::: Пациентам ::: Лечение ::: FAQ ::: Контакты ::. 
 
Диагностируем:
· Катаракта
· Глаукома
· Макулярная дегенерация
· Близорукость
· Пигментный ретинит
· Дистрофии сетчатки
· Дистрофии роговицы
· Увеиты
· Ретинобластома
· Амавроз Лебера
· Микрофтальм
· Анофтальм
· Аксенфельда-Ригера
· Ваарденбурга синдром
· Ретиношизис
· Косоглазие
· Выезд окулиста на дом
· Синдром Ашера
· Редкие болезни
 
 
Обучение
· Конференции
· Книги по офтальмогенетике
· Книга О.В. Хлебниковой Наследственная патология органа зрения
· Методы исследования в офтальмологии
· Классификация наследственных болезней сетчатки
· Критерии клинической классификации
· Форум по молекулярной медицине 2013
· Анализ геномных NGS данных
 
 
Пороки развития
· размеров и формы глаза
· придаточного аппарата
· роговицы
· сосудистой оболочки глаза
· хрусталика
· сетчатки
· зрительного нерва
· МУТАНТНЫЕ БЕЛКИ
 
 
Типы диагностики
· CLIA - что это?
· Кариотипирование
· FISH анализ
· SKY тест
· SSDGE или SSCP
· DGGE
· RFLPs
· Специфичный микрочип
· Типичный микрочип
· Прямое секвенирование
 
 
Панели тестов
· Панель "цилиопатии"
· Панель "пигментный ретинит"
· Панель "все глазные заболевания"
· Животные модели
· Пигментный ретинит: новости 2013
· Метаболизм сетчатки
· Дегенерация сетчатки и клеточная биология
 
 

Генетическая диагностика глазных заболеваний

Меня часто спрашивают: чем ты занимаешься? В чем заключается твоя работа? Как проводятся генетические тесты глазных болезней? Как давно их начали проводить? В каком направлении сегодня движется развитие технологий генетической диагностики? В чем преимущества того или иного способа? Каковы основные тренды?

Поэтому я решила пошагово ответить на эти вопросы и описать, в чем же собственно смысл генетической диагностики глаз. Вот реальный случай из моей клинической практики. Молодые активные родители, мама и папа абсолютно здоровы, ребенку 1 годик, по клиническим признакам ставят редкий диагноз, ребенок абсолютно слеп, не различает контуры предметов. Раньше врачи убедили бы родителей, что действенными методами возвращать зрение нынешняя медицина не обладает. А сейчас веры и силы воли родителей хватило для того, чтобы перерыть всю информацию в Интернете, посетить все ведущие медучреждения, занимающиеся данной патологией, уже сегодня докопаться до одной наиболее вероятной причины неспособности своего ребенка видеть, они провели всевозможные тесты и нашли поломку одного из генов. Их поиски методов лечения данной поломки пока не увенчались успехом. Клиническое испытание по данному заболеванию планируется начать в одном из центров Европы только через 2 года. Значит, есть шанс, что через 5-7 лет на рынке появится действенное средство от болезни, ранее считавшейся неизлечимой.

Это один из множества примеров. Сейчас ученые достигли больших успехов в лечении редких, однофакторных болезней, где причина одна и она ясна. В будущем, когда разберемся с редкими, так называемыми «моногенными» заболеваниями, нам будет легче перейти к лечению более частых, многофакторных, запутанных заболеваний.

С чего все начиналось?

О генетических методах лечения стали говорить еще в 1960-х после открытия двуспиральной ДНК биологами Уотсоном и Криком. В 1970-х появился революционный метод Сенгера для определения последовательности нуклеотидов в гене, что привело к накоплению и пониманию большого количества информации. Но самых больших результатов в ДНК диагностике и лечении человечество достигло в последние 10 лет, применяя нарастающие по экспоненте скорости обработки данных, их хранение и обработку. Нашумевший проект «Геном человека», когда научные центры нескольких стран объединили свои усилия, стал отправной точкой для понимания множества механизмов работы человеческого тела и дал людям осознание, что человечество способно работать в команде на уровне всей планеты и способно охватывать разумом такое количество информации, которое раньше считалось невозможным.

Дело в том, что для генетики нет границ: глазное, эндокринное или сердечное заболевание. Есть последовательность из четырех видов нуклеотидов: A , C , G , T («букв»), всего 3 миллиарда пар нуклеотидов. По алгоритму, заложенному в этих буквах, и строится наше тело. А вот к какому комплексу патологий приведет перестановка (мутация) той или иной буквы кода нашего тела, разбирается уже клиницист определенной специальности при обращении конкретного пациента с конкретной проблемой. Поэтому здесь важно понимать, что необходимо работать в команде клиницистов, генетиков, молекулярных биологов, технологов и программистов. Моя специализация – глазные проявления генетических перестановок.

Как проводят генетическую диагностику?

Во-первых, необходимо получить биологический материал, содержащий достаточно клеток с ДНК. Это может быть кровь, эпителий со внутренней поверхности щеки, слюна, ногти, волосы, биоптат тканей и пр. Наиболее удобна в данном случае кровь, потому что она содержит много клеток с ДНК, в отличие от слюны или эпителия со щеки, а также в ней меньше чужеродных организмов (бактерий, например). Однако для разных тестов могут больше подходить разные биоматериалы.

Во-вторых, из полученного биоматериала необходимо выделить достаточное для анализа количество ДНК. Это тоже целая наука, основные способы которой уже отработаны, понятны и не представляют сложности при соблюдении технологии.

В-третьих, нужно выбрать метод анализа ДНК: их очень много, у каждого свои особенности. Технологии, лежащие в их основе, гениальны, виртуозны, часто просты и восхищают тем, до чего только может додуматься человек, когда работает с чем-то, что не может ни пощупать, ни понюхать, ни увидеть. Подробнее об этом можно узнать здесь: oftalmic.ru/technology.php. Скажу только, что наиболее часто используемые сейчас методы – это секвенирование (узнавание последовательности нуклеотидов в гене) нового поколения (NGS), классическое секвенирование по Сенгеру и ПЦР в реальном времени. Итак, специалисты выбрали метод, которым они провели анализ и получили результат теста. В идеале – это точная последовательность нуклеотидов в гене, прочитанная без ошибок.

В-четвертых, нужно разобрать полученный результат «по буквам» и сказать пациенту, что же именно в его случае привело к болезни. Вот на этом этапе рухнули многочисленные ожидания «чудес» медицины нового тысячелетия. Что делать с полученным результатом, он явно ценен, но как понять эту шифровку? Как его применять с пользой для пациента?

интерпретация ДНК теста. как применять генетический тест в клинике

Здесь мы похожи на мартышку с айфоном, зато мы честно признаемся в том, что знаем мало и стараемся узнать больше. Вот клинический пример. На картинке приведена последовательность одного из моих генов:

Цветные пики соответствуют типу нуклеотида в определенной позиции: аденин, тимин, гуанин и цитозин, это результат секвенирования по Сенгеру. Черным показана значимая мутация в моем гене. К счастью, только в одной из двух копий, то есть мутация гетерозиготна – сломана только одна копия гена, а не обе. В результате синтезируется белок с неправильной структурой. Что это значит? К чему это приведет? В точности мы пока не знаем. Как узнать? Узнать точно можно только сложив полностью мозаику, которой мы по сути являемся.

секвенирование по Сенгеру влияние мутации на клиническую картину глазной болезни

В базе данных GenBank в открытом доступе лежит вся информация, полученная во всем мире о нормальном геноме и известных на сегодняшний день мутациях и их влиянии на здоровье. Таким образом, мы, получив сиквенс (последовательность), сравниваем его с нормой ( refseq – reference sequence ), изучаем информацию о найденных мутациях, если они есть, и на основании этого анализа делаем заключение: связано развитие болезни с этой мутацией или нет.

Сложность в том, что уже опубликованы сотни тысяч статей о найденных единичных мутациях. Пока еще никто в мире четко не представляет, каким же способом анализировать взаимосвязи и взаимовлияние мутаций в разных генах. Для этого нужны супераналитики, суперкомпьютеры, суперпрограммисты. Причем даже суперпрограммисты не помогут, если супераналитики (это очень общее определение, как вы понимаете) не поставят программистам четкую задачу: что же все-таки нужно искать и вычленять в этой базе данных.

Добавлю информации к размышлению: не только геномные аномалии ведут к болезни, но и эпигеномные взаимодействия. То есть иногда, даже при четко доказанной мутации, болезнь не проявляется, так как присутствуют какие-то компенсирующие ее механизмы (на уровне над-геномного взаимодействия), иногда одна и та же мутация приводит к абсолютно разным болезням. Иногда мутации в сотне разных генов приводят к одной и той же болезни. Окончательно ошеломившим меня фактором явилось то, что у каждой популяции людей свой набор мутаций, например, японские тест-системы для россиян не подойдут, даже супер-качественные, потому что они определяют те мутации, которых почти нет у россиян! У нас свои собственные, пока еще никому не известные. Единственный способ – создать свои системы на основе анализа данных российской популяции.

Дорогое удовольствие?

ПЦР (полимеразно-цепная реакция) в реальном времени является отличным недорогим способом для поиска замен «букв» в известной позиции гена. А что делать, если мы не знаем, в какой позиции произошла мутация? Мы знаем только ген, в котором она наиболее вероятна. Зная ген болезни, мы можем полностью просеквенировать его, например, по Сенгеру. Тоже довольно точный, удобный и недорогой способ для коротких генов. Но часто мы не знаем не только в какой позиции, но и в каком гене произошла мутация, а имеем только предположительный набор генов, в которых мутация наиболее вероятна при данных проявлениях болезни. Что делать в таком случае? Если секвенировать приходится несколько десятков генов и если гены длинные, то цена за анализ методом Сенгера может быть более 300 тысяч рублей (подробнее о том, почему).

В таком случае встает очевидный вопрос: если просеквенировать все гены сразу (всего их около 25000) с помощью секвенирования нового поколения стоит 300 тысяч рублей, то зачем секвенировать только эти 20 генов за те же 300 тысяч, может, тогда быстрее, проще и дешевле сделать анализ всех генов сразу, тогда мы получим более богатый исходный материал и сможем если не сейчас, то когда накопятся нужные данные, проанализировать гены, не делая этот дорогой тест повторно, а просто используя полученные ранее результаты.

Вот это идея! Имея представление о том, как проводится секвенирование по Сенгеру, я решила узнать, как же выглядят результаты полногеномного секвенирования, чтобы представить, как с ними можно работать. Самым многообещающим аппаратом на рынке полногеномного секвенирования (хотя их несколько разных видов и технологий) считается аппарат марки Illumina (Иллюмина). Он довольно дорогой, в Москве есть несколько таких аппаратов в разных учреждениях. Мне давно хотелось посмотреть, как выглядит геном (геном – совокупность всех генов, определяющая свойства человека, это последовательность из трех миллиардов букв A , C , G , T ). Если не удастся посмотреть на геном, то хотя бы на экзом (экзом – совокупность всех частей генов, экзонов, с которых идет синтез белков – кирпичиков тела человека, что составляет 1 – 2% от всего генома). Как это выглядит после анализа образца крови на Иллюмине? С чем предстоит работать? Все говорят: «Иллюмина, Иллюмина, купил ее за миллион долларов и все проблемы решены». Однако с ее покупкой они только начнутся. То, что я увидела, превзошло все мои ожидания.

Представьте себе текстовый файл, где массив сформирован в группы по 4 строки, первая строка – код дорожки чипа, вторая строка – непосредственно последовательность нуклеотидов (короткая цепочка 25-50 букв), третья строка – степень достоверности прочтения каждого нуклеотида и четвертая строка – количество перекрываний и прямое или обратное это считывание. Приблизительно так:

как выглядит геном? экзом данные с аппарата illumina

Данный текстовый файл весит 28 гигабайт!!! О! Вот вы его получили, распечатали для пациента, чтобы он понял, за что заплатил деньги (толщина книги получится больше 5-и метров и этот пациент перестанет быть вашим пациентом, он пойдет к хирургу с грыжей). Вот результат. Пожалуйте! Следующий вопрос: что делать с этим файлом?

Если вы секвенируете старым способом по Сенгеру отдельные гены, то опытным взглядом можете посмотреть на буквы и сказать: «О, это мой сиквенс, эти гены мне знакомы». На Иллюмине жизни не хватит, чтобы просто просмотреть весь этот файл глазами.

Я уверена, что со временем мы научимся работать с такого рода массивами данных, потому что опыт человечества в этом вопросе с каждым днем растет. Причем нужно учесть, что здесь, по сути, не важна исходная область получения данных: финансовые, математические или медицинские массивы данных. Вот мы и дошли до вопросов: в каком направлении сегодня движется развитие технологий генетической диагностики? В чем преимущества того или иного способа? Каковы основные тренды? Теперь, представляя себе предмет исследования, вы можете по-разному ответить на эти вопросы. Все зависит от ваших целей. Моей целью является data mining – то есть создание клинически полезной информации из массивов данных генома в области глазных заболеваний.

Из полученного файла сначала нужно сформировать контиги - "склеить" в цепочку короткие фрагменты (25 - 50 нуклеотидов) генов. Затем нужно вычленить из полученного массива данных необходимые в определенном клиническом случае гены, собрать достоверно имеющиеся точечные мутации, соотнести их с базой данных всех людей, для которых полученая эта информация, статистическими методами определить наиболее вероятные мутации, приведшие к заболеванию.

Клиническое заключение по данным генетического анализа

На основе имеющихся в мире данных о достоверных взаимосвязях между мутацией и болезнью мы разрабатываем малого объема тесты, например, выявляем наличие или отсутствие трех точечных мутаций в гене, которые очень часто приводят к болезни. По мере накопления знаний об особенностях российской популяции мы расширяем, улучшаем и уточняем уже имеющиеся у нас тесты, а также разрабатываем новые. В таком случае мы с большей вероятностью дадим достоверные клинически полезные сведения для лечения пациента.

Задать вопрос

(c) Марианна Иванова, ноябрь 2012

 
 
 
  Как собирать образцы для генетического анализа
Как собирать образцы для генетического анализа
 
  ДНК диагностика глазных болезней в России и СНГ
Мы работаем в России и странах СНГ
 
  Как проводится генетическая диагностика в офтальмологии
Как проводится ген.диагностика
 
  Цены на ДНК диагностику глазных болезней
Из чего складывается цена анализа?
 
  Как правильно рисовать генеалогическое дерево
Как правильно составлять историю здоровья семьи?
 
  секвенирование нового поколения
Используемые нами технологии
 
  клинические признаки при генетической диагностике
Необходимые для ген.анализа клинические данные
 
  Organum visus Голубев Сергей Юрьевич
Информационный партнер проекта
 
  Профессионально о зрении портал OD OS
Информационный партнер проекта
 
 
Copyright © Офтальмик 2008 - 2017